活细胞成像对于研究生物过程的机制和动态至关重要，无论是在低分辨率还是高分辨率下均是如此。因此，选择最合适的显微镜方法以维持活细胞的正确环境、获取有意义的数据和高质量图像至关重要。出于这些原因，成功进行活细胞成像实验可能颇具挑战性，而先进的显微镜技术正是在这一环节发挥作用。如前所述，活细胞成像的主要关注点在于：在正确的环境条件下维持生物样品的活性、设置正确的延时采样率，以及避免荧光标记随时间推移发生光漂白。此外，激发光可能损伤细胞器，导致样品生理功能受损，在某些情况下甚至造成样品死亡；因此，所使用的激光功率和曝光时间是需要重点关注的重要参数。确保这些现象不会发生至关重要，因为它们可能改变实验所得出的结论。选择无毒、明亮且光稳定的荧光团是成功成像的第一步，同时还需正确设置采集参数。然而，即便遵循了这些注意事项，如果荧光激发和发射效率不理想，且光功率长时间照射样品，实验仍可能出现问题。
X-Light V3
旋转盘共聚焦显微镜相比传统激光扫描共聚焦显微镜在活细胞成像方面具有诸多优势，尤其是在配备尖端技术和高质量硬件的情况下。CrestOptics X-Light V3拥有合理的硬件配置，能够快速且温和地对您的样品进行成像，在低光照条件下提供高质量图像。优化的光路（图1）和最优的圆盘图案（图2）使活细胞成像成为可能，同时显著降低光漂白的概率。优化的光路与高效的荧光检测机制相结合，可有效抑制反射光。得益于量子效率高达95%的相机（相比点扫描共聚焦中PMT的45%），检测信号得到最大化。此外，照明区域与相机探测区域的精确匹配，相比宽场荧光成像减少了视场（FOV）之外光毒性产物的产生。这意味着可以使用低激光功率和短曝光时间来实现高共聚焦通量和速度。
图1：X-Light V3旋转盘共聚焦示意图。激光光束通过多模光纤进入V3，经过微透镜阵列和激发滤光轮；准直光随后通过圆盘的针孔聚焦到样品上。来自样品的发射光经过二向色镜和发射滤光片，所选发射频率由相机探测。
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图2： A）高通量盘，B）标准盘，C）深穿透盘。
此外，我们的圆盘可根据不同针孔尺寸和间距进行定制，以满足成像需求并最大限度降低光漂白概率（表1）。有关如何将圆盘图案与您的应用匹配的更多信息，请访问我们的网页技术页面。圆盘的各种布局设计旨在为您的荧光标记样品提供针孔串扰与3D光学切片能力之间的最佳平衡。
此外，我们旋转盘的高转速（15000 RPM）可实现1400 fps的采集速度，结合快速高灵敏度sCMOS相机的使用，可捕捉快速动态的生物过程。另一个优势在于FOV的尺寸。25 mm的视场减少了采集足够数据所需的图像数量，再次降低了光漂白的概率。此外，得益于微透镜技术，均匀准直光束可在整个FOV范围内提供90%以上的均匀照明。最后，沿激发和发射光路分别设置的两个光阑有助于保持样品完整性并降低激发光强度。
实际上，由于在旋转盘前设置了照明光阑，样品仅暴露于一小部分激发光下，因此其特性得以保持完好。
圆盘类型 | 应用场景 |
高通量 | 薄样品的超快速成像 |
标准 | 活细胞成像、细胞单层或组织 |
深穿透 | 厚散射组织（超过100微米） |
定制 | 客户特定应用 |
表1：X-Light V3旋转盘布局选项。定制圆盘还支持在同一圆盘上选择双图案。
X-Light V3的活细胞成像能力已在我们的应用笔记中得到充分展示。利用X-Light V3，可以在大视场下进行快速活细胞成像，然后聚焦于单个细胞，以高分辨率追踪溶酶体动态（利用结构光照明显微镜观察活细胞细节与动态）。对IFT-NG细胞进行延时成像，以187 fps的高速采集率追踪绿藻纤毛微管上下运动的颗粒（沿绿藻纤毛上下运动）。
我们进行了3D堆叠和延时成像，以精确研究蛋白质定位和荧光随时间的稳定性，证明可以在保持细胞健康的同时可视化内源性表达的荧光蛋白并避免荧光漂白（梦想成真：通过共聚焦显微镜实现酵母长期成像）。我们成功对生长在3D基质上的尤文肉瘤A637细胞进行了长期活细胞实验，在530微米厚的样品上追踪了72小时延时实验中的凋亡效应（VITVO®中抗癌治疗效果的活细胞成像）。
DeepSIM
小结构的动态事件需要超分辨率才能真正捕捉和理解真实的生物事件。一个能够同时提供无伪影超分辨率和高成像速度的可靠系统发挥着重要作用。DeepSIM作为X-Light V3的附加模块（图3A），具备快速成像、适当穿透深度且无需特殊探针的能力。DeepSIM完整保留了X-Light V3从光源到相机的全部功能。这意味着成功进行活细胞成像实验的所有优势均得以保留，同时以大于10fps的时间分辨率（1024×1024像素视场）增加了超分辨率能力。只需简单点击即可将X-Light V3的旋转盘从光路中移除并切换至超分辨率模式（图3B）。
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图3：A）X-Light V3+DeepSIM附加模块超分辨率模式示意图。激光光束通过多模光纤从V3进入，经过微透镜阵列和激发滤光轮；旋转盘从光路中移除。准直光进入DeepSIM，通过掩模针孔聚焦，晶格图案通过电动振镜投射到样品上。来自样品的发射光经过V3的二向色镜和发射滤光片，所选发射频率由相机探测。B）X-Light V3+DeepSIM附加模块旋转盘共聚焦模式示意图。激光光束通过多模光纤进入V3，经过微透镜阵列和激发滤光轮；准直光通过重新插入光路的旋转盘针孔聚焦。激发光随后进入DeepSIM，绕过掩模和振镜。激发光到达样品后，发射光通过与V3独立模式相同的发射光路传输至相机。
DeepSIM是一种晶格多点结构光照明系统，可提供约100 nm的XY分辨率和约300 nm的Z分辨率光学切片（100X，1.45 NA）。 我们提供三种多点掩模图案以满足广泛的应用需求（见下表）。
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图4：A）高通量掩模，B）标准掩模，C）深穿透掩模。
掩模类型 | 应用场景 |
高通量 | 活细胞成像、薄样品及厚样品（最厚约50微米） |
标准 | 活细胞成像、薄样品及厚样品（最厚约100微米） |
深穿透 | 致密均匀结构、深层成像（超过100微米） |
表2：DeepSIM晶格掩模布局选项。
DeepSIM用于活细胞成像的主要优势来自晶格SIM技术。晶格SIM通过使用多点图案掩模（而非栅格线）克服了经典SIM的局限性，且图案仅进行横向平移而无需旋转。以这种方式，光和时间得到高效利用，实现了活样品的快速温和3D超分辨率成像。此外，多点图案提供了更高的对比度，使图像重建更加稳健。此外，DeepSIM利用X-Light V3的激发和发射光路，在最大化照明的同时降低光漂白概率。
请参阅我们最新的DeepSIM应用笔记“利用结构光照明显微镜观察活细胞细节与动态”，以充分了解CrestOptics DeepSIM在活细胞成像方面的优势。我们聚焦于HeLa细胞溶酶体，追踪其快速运动长达30秒连续记录，并对HeLa细胞分裂进行了长达12小时15分钟的长期成像（间隔15分钟）。
CrestOptics X-Light V3及配备DeepSIM的X-Light V3是对活体样品进行高分辨率和超分辨率成像的理想解决方案，充分利用了最新技术优势。 这些系统的另一个优势是多激光线兼容性，支持使用多种荧光团。您可以选择在可见光谱和近红外范围内成像，波长最高可达750 nm。这对活细胞成像实验带来了显著益处，因为可以使用远红和近红外光谱的标记物，降低光毒性概率，并通过避免通道串扰实现多标记选择。此外，X-Light V3配备两个相机接口，可在两种模式下同时成像，为您的实验提供更大的灵活性。最后，我们系统的设计支持使用显微镜环境培养箱，将样品完全封闭在受控环境中维护。由于兼容最常见的显微镜底座品牌，对于需要更受控环境的样品，也可以使用载物台顶部培养箱。
访问我们的产品页面，了解更多关于CrestOptics X-Light V3和DeepSIM的详细信息。联系我们预约演示，亲眼见证其卓越性能。
