Human Technopole 的光成像设施，米兰（意大利）
Human Technopole（米兰）秉承了 2015 年米兰世博会的传统，代表了意大利新的生命科学参考研究所。如果全面投入运营，该研究所可以在超过 35,000 平方米的实验室空间内接待各领域（生物学、生物信息学、化学、工程、数学和计算机科学）的 1,000 多名科学家。借助对人类生物学的全球性跨学科研究，Human Technopole (HT) 的研究旨在了解各种疾病的机制，以改善医疗保健系统和整体生活质量。为了实现这一目标，HT 园区为 HT 科学家提供六个支持设施。
“光成像设施 (LIF) 可以为 Human Technopole 的所有研究人员实现他们的目标提供支持，”Human Technopole 光学显微镜设施高级经理 Nicola Maghelli 博士说。“我们提供尖端显微镜，用于对各种样本进行成像，与生物学家和图像分析科学家密切互动，以提供最好的服务。成像是许多研究项目的基础，光成像设施致力于实现卓越：当涉及到我们的科学家所使用的显微镜的质量和性能时，我们坚守零妥协原则，”Nicola Maghelli 补充道。
使用四摄像头转盘式装置进行实时成像
LIF 提供多种最先进的共聚焦系统，包括单光子和多光子、超分辨率系统和宽视场落射荧光显微镜。该成套设备最近补充了一个高端转盘式共聚焦系统（X-Light V3，Crestoptics），配备四个 sCMOS 装置。“在不牺牲速度的前提下，可以在 25 mm 视场上对四个通道同时成像，这是一个巨大的优势。转盘式显微镜以其卓越的成像速度而闻名：遵循我们的零妥协原则，我们决定不牺牲这类系统的速度，并在采集两个以上通道时保持大视场。这只能通过设置 4 个摄像头来实现。”Nicola Maghelli 表示。 “这种系统在 Human Technopole 的主要应用涉及成像速度至关重要的项目。对快速动力学的研究，例如单细胞水平的钙离子信号发送或传输，将受益于同步 4 色采集装置，这有助于更全面地理解这些机制，”Nicola Maghelli 说。 X-Light V3 转盘式系统利用 25 mm 大视场对更复杂的细胞网络或更大的样本（直至多细胞生物，如类有机生物）进行成像，将为在更小的空间尺度上进行的实验鼎力相助。此外，更高的成像速度（高达 500 fps）可以用于对更大的样本进行成像。“目前正在进行的另一个项目受益于系统的采集速度，是对扩展样本超微结构的相关光学-电子显微镜成像：将一系列重叠的图像拼接在一起，即使使用高倍率物镜，我们也可以对几毫米的区域快速成像。使用电子显微镜对同一样本进行成像后，我们可以将获得的荧光信号与样本的超微结构关联起来。最后，相信我们的科学家将提出新颖的应用和原创的想法，充分利用装置的功能，”Nicola Maghelli 说。HT 光成像设施的未来发展前景
光成像设施面向 HT 科学家开放。该设施致力于跟上成像技术和用户需求的不断发展。 “我们的转盘式系统已经是一个非常灵活且功能强大的平台，用于执行复杂和要求苛刻的实验，其中可以包括光活化和显微操作，以及在大视场上快速成像。不过，我认为增加对微流体的支持会使我们的系统更加灵活。此外，有些应用可能受益于 DeepSIM 超分辨率模块 (Crestoptics) 的潜在系统升级。这将是对大规模、快速视场采集的理想补充，并允许深入研究样本中选定子区域的细节，”Nicola Maghelli 说道。
Nicola Maghelli PhD
Human Technopole 光成像设施高级经理
“CrestOptics X Light V3 转盘式共聚焦装置的独特功能，例如易于互换的圆盘装置与大视场、照明成形和均匀性相结合，是使其脱颖而出并最终说服我们采用该系统的关键因素。”
聚光灯下：Gaia Pigino 小组，Human Technopole 结构生物学研究中心
Gaia Pigino PhD
Human Technopole 结构生物学研究中心研究组组长兼副主管
Pigino 小组研究人类病理学中的纤毛和纤毛功能障碍。纤毛是细胞器，从胚胎发育的早期阶段（协调脊椎动物身体的典型左右不对称）到胚胎发育的后期阶段（驱动特定组织和器官的正确发育和功能），纤毛都是基本的细胞器。最终，我们通过感觉纤毛感知周围的环境：通过视网膜中光感受器的连接纤毛观察，通过嗅觉神经元顶端的感觉纤毛嗅闻，通过感觉毛细胞的动纤毛倾听。运动纤毛也具有感觉功能，它们像螺旋桨一样延伸，通过保持肺部清洁使我们能够呼吸，通过推动精子细胞使我们能够繁殖，甚至使我们能够思考，因为它们有助于我们脑室中脑脊液的流动。Pigino 小组使用各种模式生物，如莱茵衣藻和四膜虫；原代细胞和细胞系；以及组织，现在正转向 3D 培养，如类器官。对于它们的组装，所有纤毛都需要一个特殊的双向分子运输系统，称为鞭毛内运输 (IFT)。IFT 列车，类似于真正的列车，以大约 4 微米/秒的速度在微管上上下移动纤毛，微管是纤毛的轨道。IFT 列车将纤毛的构建模块从细胞体向上运送到纤毛的尖端，然后返回底部重新装载并重新开始另一次旅行。
IFT 列车还携带从纤毛尖端释放的信号分子，并将信息传递给周围的细胞。许多纤毛疾病是由 IFT 基因突变引起的，然而，我们仍然不知道 IFT 列车是如何在分子水平上形成和发挥作用的。
“高端转盘式共聚焦系统（X-Light V3, CrestOptics）具有四个 sCMOS 装置，用于研究纤毛的生长。通过这个系统，可以同时跟踪多达 4 种不同荧光标记蛋白的动态，就好像 IFT 系统的马达、适配器和货物。同时采集可以提高数据的可靠性和稳定性，允许准确比较不同蛋白质复合体在相同条件下的行为，”Gaia Pigino 说。摄像头的大视场允许在同一视场中对多个纤毛进行成像，并获得足够的定量和统计分析所需的数据。“重要的是，与 TIRF 等其他技术相比，CrestOptics 系统使我们能够在更深的 Z 中对样本进行成像。此外，CrestOptics 转盘式系统允许我们以比共聚焦更快的速度扫描 Z 中的纤毛，同时减少激发激光引起的损伤，”Gaia Pigino 说。这些条件是记录 4 种蛋白质行为的最佳条件，例如在微管上以 4 微米/秒的速度运行的 IFT 列车。该系统配备了 2 个微型操纵器和泵，我们将使用它们来局部改变环境并操纵细胞和纤毛，同时观察它们中的快速动态分子过程。Gaia Pigino 总结道：“得益于 CrestOptics 和尼康系统的模块化，我们能够建立一个适合我们当前需求的系统，并可以选择未来的集成或修改，以满足我们未来的需求。”
转盘式控制系统
Human Technopole 采用的定制解决方案包括安装在尼康 Eclipse Ti2 倒置显微镜上的 X-Light V3 转盘式共聚焦系统 (CrestOptics)，该显微镜具有 25 mm 的视场。MultiCam 图像分离器 (Cairn Research) 连接四个 Prime 95B 25 mm sCMOS 摄像头 (Teledyne Photometrics)，具有 95% QE、25 mm 视场（与尼康显微镜的大视场相匹配）和 11µm 像素尺寸，以获得更高的灵敏度来检测微弱信号。共聚焦通过两个旋转的圆盘实现：(i) 具有 50µm 针孔直径的标准圆盘，用于在对厚度大于 30µm 的样本或澄清组织进行成像时使空间分辨率最大化，以及 (ii) 具有 50µm 大小的网格线（而不是针孔）的高通量狭缝盘，用于在光通量更重要的情况下对样本进行快速多色实时成像。照明由多模 7 线激光源 (Celesta，Lumencor) 组成，在执行四色同时激发时，可更灵活地选择荧光团。该系统还配备了载物台培养箱(Okolab) 和微操纵器，以扩大活细胞成像的可用实验范围。
四摄像头装置的独特优势
四摄像头装置提供了不牺牲速度或 25 mm 视场的选项，同时使用户能够在四个独立的 Prime 95B sCMOS 中同时激发和采集多达四个通道。在最初的实验中，光成像设施的工作人员达到了 25 fps 的时间分辨率，这意味着以 40 毫秒的速度曝光 4 个荧光团通道，这是一个非常好的时间曝光，即使是微弱的信号也能激发。结果是，与单通道连续曝光的单摄像头装置相比，采集速度提高了 4 倍。 实践证明，配备四个摄像头装置的 X-Light V3 转盘式系统也非常有用，在短短 3 分钟内即可对大型类器官进行成像，点扫描共聚焦系统所需的 45 分钟采集时间是其 15 倍。特别是，Human Technopole 的自动化干细胞和类器官设施将受益于这种转盘式装置的高通量和时间分辨率，每天可以分析数百个大型类器官（大小为 500-1000 微米），这是点扫描共聚焦显微镜无法实现的。 CrestOptics 与尼康欧洲分公司：在生命科学显微镜市场长期合作
Alberto Zorloni
尼康欧洲分公司，尼康意大利分公司，伦巴第研究市场销售经理
“尼康仪器和 CrestOptics 之间富有成效的合作在意大利生命科学显微镜市场成就了许多成功案例。 尼康一直与 Human Technopole 员工保持直接联系，充当与系统制造商 CrestOptics 的桥梁，并为最终用户提供额外的科学和技术支持。促进 CrestOptics 与 Human Technopole 之间的互动将对下一代技术的发展产生积极影响。”
