肿瘤研究进展：3D 肿瘤球体成像

最近的研究中有证据揭示了肿瘤微环境在肿瘤发展和进展中的关键作用，在这种情况下，传统的二维 (2D) 培养系统风险代表了一种简化方法。在二维模型系统中，细胞生长在平坦的固体表面，没有细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用；此外，单层细胞获得导致异常基因和蛋白质表达的人工细胞骨架重排。

反，细胞在三维 (3D) 条件下的生长刺激了更相关的细胞结构的获得，提供了建立细胞-细胞或细胞-基质相互作用的机会，从而创造了一个与肿瘤的自然环境非常相似的空间组织。3D 细胞培养模型表现出反映体内肿瘤的异质性和结构复杂性，从而更准确地表达了肿瘤疾病中发生的肿瘤生理学。

在生物化学和细胞生物学研究所（意大利国家研究委员会，罗马），Fabiola Moretti 博士和她的团队正在研究调节细胞对应激刺激的反应机制，尤其对激素依赖性肿瘤感兴趣。Moretti 团队的 Rita Assenza 博士已经应用 3D 细胞培养系统研究了肿瘤细胞对化疗和靶向治疗联合疗法的反应。

为了生成 3D 球体，将 NCI-H460 细胞（源自非小细胞肺癌）以两种不同的密度接种在超低吸附培养板中：3×103 个细胞/孔或 700 个细胞/孔。在直径分别达到约 400-500 或 150-200 um 后，用细胞毒素剂处理球体 6 天。通过使用钙黄绿素 AM 和碘化丙啶 (PI) 的活/死染色来观察和评估药物的效果。钙黄绿素 AM 是一种细胞渗透性染料，用于测定细胞活性。非荧光钙黄绿素 AM 在活细胞中被细胞内酯酶水解后转化为（绿色）荧光钙黄绿素。PI 是一种红色荧光核染色剂，通常用于检测死亡细胞，因为它不能进入完整的活细胞。最后，使用 Hoechst 染料将细胞核染成蓝色。

我们采用 CrestOptics X-Light V3 转盘共聚焦结合 Prime BSI 相机（Photometrics，像素尺寸 6.5 um）进行采集。我们比较了使用 20 倍空气物镜（CFI Plan Apo Lambda，尼康，0.7 NA 和 1mm WD）和 25 倍硅油物镜（CFI Plan Apo Lambda S，尼康，1.05 NA 和 0.55 mm WD）进行的采集。在图 A 中，我们展示了从总共 150 um 的 Z 堆栈中获得的最大强度投影 (MIP) 图像；特别是，使用 20 倍空气物镜和 25 倍硅油物镜获得了相同的球体。图 B 显示了使用两种物镜获得的 3D 球体同一区域的放大。

为了更好地理解 3D 细胞组织，在图 C 中，我们展示了使用两种物镜获得的同一球体的体积视图（120 um 厚），甚至在 3D 肿瘤球体的更深区域也能看到染色。最后，在 图 D 中，显示了使用 25 倍硅油物镜获得的整个球体的 3D 电影特效。

使用 20 倍空气物镜和使用 25 倍硅油物镜获得的图像之间的比较（图 A、B 和 C）突出了基于生物应用的透镜选择的重要性。从 20 倍到 25 倍的转换导致分辨率提高（基于 25 倍的 NA 大于 20 倍 NA），这当然会影响图像质量，并且还会导致光折射减少。事实上，浸油通过用更高折射率的介质代替透镜和盖玻片之间的空气间隙，大大提高了显微镜的分辨率，从而减少了光的折射。

总之，3D 肿瘤球体培养是一种新兴工具，提供了更具生理学代表性的肿瘤疾病模型。凭借其 3D 复杂性，与传统 2D 相比，它们代表了向前迈出的决定性一步，并为创建用于抗癌药物发现的筛选平台奠定了基础。

在 3D 成像中，样品的折射率与其浸没介质的折射率相匹配对于深层组织观察至关重要。硅酮浸油非常适合透过厚厚的生物样本进行成像；它与细胞和封固剂的折射率非常吻合，与使用普通 20 倍空气物镜获得的图像相比，减少了球面像差，产生了更亮、分辨率更高的图像。