欧洲肿瘤研究所的研究世界
IEO（欧洲肿瘤研究所）是世界上最负盛名的医院之一，也是欧洲发展最快的综合性癌症中心。该研究所整合了与抗癌相关的各个领域，例如预防、诊断、治疗、培训和教育、基础研究和转化研究。在 IEO，300 名科学家将临床和研究活动完美结合起来，致力于发现癌症发展中涉及的分子机制，以尽快将科研结果转化为治疗方法。基础研究和转化研究在位于意大利米兰 Via Adamello 16 校区的实验肿瘤学系 (DEO) 进行。
欧洲肿瘤研究所影像部，米兰（意大利）
影像部支持 IEO 科学团体，提供最先进的光学成像平台，并开发按需特定成像和图像分析协议。它在用户培训方面提供了经验丰富的帮助，允许直接使用显微镜，帮助显微技术初学者设置他们的实验，并帮助有经验的研究人员开展中试实验或应用先进成像技术。现有系统涵盖不同的显微技术，包括宽视场和共聚焦、全内反射 (TIRF)、随机光学重建显微技术 (STORM)、高内涵和延时显微技术，部门服务包括显微镜的数据备份和存储以及成像试剂管理。“我们的影像部最近配备了安装在尼康 Ti2 倒置显微镜上的 CrestOptics X-Light V3 转盘共聚焦和 DeepSIM X-Light 模块。这台设备填补了我们仪器系列中的一个现有空白，”欧洲肿瘤研究所 (IEO) 影像部的部门协调员 Simona Rodighiero 博士说。
欧洲肿瘤研究所成像开发部，米兰（意大利）
位于米兰 IEO 的成像开发部门旨在开发需要超分辨率、高内涵显微技术和计算机辅助图像采集的高端成像应用。它致力于选定的项目，与研究小组合作，为癌症研究创建通用工具。“成像开发部不直接按需进行单一实验，而是培训积极参与开发过程的研究人员。完成设置后，影像部的人员就会帮助我们推广所制作工具的使用方法，使整个部门都能使用，”欧洲肿瘤研究所 (IEO) 成像开发部的部门协调员 Mario Romolo Faretta 博士说。“我们将实验室中的任何技术都推向极限，并充分利用成像仪器进行项目开发。我们在 IEO 中采取的这种前沿和挑战的态度为前所未有的技术和科学发现机会铺平了道路，”Mario Faretta 博士补充道。
IEO 成像开发部的基于成像的空间蛋白质组学
多路复用，即在同一细胞或组织切片中标记多种免疫染色，引起了人们对肿瘤细胞、反应性细胞、炎症细胞和正常细胞原位表征的极大兴趣；这种技术推广的主要障碍是定制抗体和仪器的高成本、低通量、以及缺乏专业技能或设施 [1]。“我们已经验证了一种基于四色间接免疫荧光、图像采集和抗体去除（剥离）的方法，然后再进行另一种染色剂，”Mario Faretta 博士说。“图像经过数字配准，并消除了自发荧光。这款程序采用开源算法，自动重新对齐从连续免疫染色循环中获取的组织切片的 x、y、z 轴坐标，这包括在扫描仪或显微镜载物台上移除和更换完全相同的载玻片。超过 30 种不同的抗体染色可以应用于常规固定和包埋组织的单个切片。”Mario Faretta 博士补充道。“我们创建的管道允许在不同光学分辨率下收集多个信息数据，采用了高度自动化以及图像采集与分析之间的耦合”。
“对于这种靶向应用，CrestOptics X-Light V3 转盘共聚焦系统与尼康 Ti2 Eclipse 倒置显微镜相结合，优于我们影像部中的其他免疫荧光切片扫描仪。当运行拼接图像的平铺扫描时，X-Light V3 照明器中的微透镜块为尼康 Ti2 Eclipse 25 mm 视场提供了无与伦比的照明均匀性。即使连续平铺之间的重叠百分比很小，拼接后的图像也是高质量的，”Mario Faretta 博士说。“此外，值得一提的是，X-Light V3 转盘共聚焦的采集速度极快，它具有良好的光学切片和对重要标记的灵敏度。”Mario Faretta 博士补充道。
图 1.人结直肠癌 (HCT) 细胞的膨胀显微成像技术。HCT 细胞用 DAPI 和 Pol2S5P（显示为绿色）和 ZC3H4（显示为红色）的间接免疫荧光标记，放大约 6 倍，并使用 CrestOptics X-Light V3 转盘共聚焦采集。所示为单个平面。比例尺：20 µm
结合转盘共聚焦和结构光照明显微技术的多模态方法
原位多路复用分析和原位空间组学需要不同技术在实验过程的所有阶段持续相互作用 [2]。“因此需要新的工具，并且必须在性能和极限方面对它们进行表征，才能达到最佳分辨率和灵敏度”，Simona Rodighiero 博士说。“CrestOptics 和尼康技术的结合通过在宽视场、转盘共聚焦和 SIM 超分辨率成像模式之间无缝切换，实现了‘多模态显微镜技术’方法。这种设置使我们接受了分析驱动采集的概念，这意味着为当前实验问题所解决的生物学任务选择正确的图像采集条件。”Mario Faretta 博士补充道。“X-Light V3 的核心是大且均匀照明的 25 mm 视场的快速采集。相反，DeepSIM X-Light 可帮助我们解开超过 200 nm 光衍射极限的纳米结构，例如细胞焦点。DeepSIM X-Light 具有三种不同的 SIM 2D 晶格模式，经证明与我们实验室提供的大量样品高度兼容，从细胞单层到 3D 细胞培养和组织切片。”Simona Rodighiero 博士说。尽管荧光扫描仪提供了一种易于使用的自动图像采集解决方案，但其主要局限性是使用干燥的低放大倍率物镜。
随之而来的是高数值孔径物镜的排除，这妨碍了对衍射极限细节的研究，并降低了灵敏度 [2]。对病理样本中高空间分辨率细节的分析是一种日益增长的需求，正在刺激新的成像方法。尽管已开发的放大技术极大地增强了单个分子的空间组学信号，使其即使具有中等灵敏度和分辨率也可以检测到，但高分辨率光学显微镜提供的信噪比可减少低表达标记的正确检测、定位和分配中的误差 [2]。“在我们的多模态方法中，CrestOptics DeepSIM X-Light 技术可应用于需要增强分辨率的空间受限靶区。借助 DeepSIM X-Light，单细胞分割性能大大提高，从而为病理学家进行的经典分析提供了共聚焦系统两倍的空间分辨率”，Mario Faretta 博士总结道。
图 2.单细胞荧光共定位分析。DAPI（蓝色）、BrU 掺入（红色）和 Intronic Cyclin B1 RNA smRNA FISH（绿色）是使用 CrestOptics DeepSIM X-Light 采集的。信号共定位显示了对 MCF10A 细胞新生转录物的有效检测。
技术概述：X-Light V3 转盘共聚焦和 DeepSIM X-Light 模块的组合设置
欧洲肿瘤研究所 (IEO) 采用的高端系统由一台 X-Light V3 转盘共聚焦 (CrestOptics) 和一台 DeepSIM X-light (CrestOptics) 组成，安装在尼康 Eclipse Ti2 倒置显微镜左侧摄像头端口上，配有 25 mm 视场。背照式 Kinetix sCMOS 摄像机 (Teledyne Photometrics) 用作检测器。这款相机覆盖了尼康显微镜的 25mm 大视场，具有 96% 的量子效率和 0.7 的低电子读取噪声，可增强检测微弱信号的灵敏度。凭借其 6.5 um x 6.5 um 的像素面积，使用 DeepSIM X-Light 模块可以获得清晰的图像。利用 8 位读出模式，Kinetix sCMOS 在全帧中提供了惊人的每秒 498 帧 (fps)，通过 X-Light V3 转盘共聚焦实现了最快采集。共聚焦是通过一个针孔直径 50 µm 的电动转盘实现的。照明由 Celesta-7 (Lumencor) 多模高功率激光源组成，可在执行多重染色时更加灵活地选择荧光团。该系统还配备了微流控平台 (Elveflow)，用于扩大采用液体处理自动化的可用实验范围。
CrestOptics 与尼康欧洲分公司：在生命科学显微镜市场长期合作
Alberto Zorloni
尼康欧洲分公司，尼康意大利分公司，伦巴第研究市场销售经理
尼康仪器和 CrestOptics 之间富有成效的合作在意大利生命科学显微镜市场成就了许多成功案例。尼康一直与 IEO 员工保持直接联系，充当与系统制造商 CrestOptics 的桥梁，并为最终用户增加了科学和技术支持方面的附加值。促进 CrestOptics 与 IEO 之间的互动将对下一代技术的发展产生积极影响。
