在研究生物过程的机制和动态时，无论是低分辨率还是高分辨率，活细胞成像至关重要。因此，选择最合适的显微镜方法以维持活细胞的正确环境、获得有意义的数据和高质量的图像至关重要。鉴于这些原因，进行成功的活细胞成像实验变得极具挑战性，但先进的显微镜技术正是解决这些问题的关键。如前所述，活细胞成像的主要问题是，在正确的环境条件下保持生物样本的活性，设置正确的延时采样率，并避免荧光标记随时间漂白。此外，激发光会对细胞区室造成损害，导致样品生理功能受损，在某些情况下还会导致样品细胞死亡；因此，需要特别注意使用的激光功率和曝光时间，这是非常重要的数据。因为这些现象会改变从实验中得出的结论，确保这些现象不会出现至关重要。成功成像的第一步是选择无毒、明亮且光稳定的荧光团，同时还要设定正确的采集设置。然而，即使遵守这些权宜之计，如果荧光激发和发射效率不尽理想，光功率长时间到达样品，也可能会出错。
X-Light V3
与传统的激光扫描共聚焦显微镜相比，旋转盘共聚焦显微镜在活细胞成像方面具有众多优势，尤其是在配备了尖端技术和高质量硬件的情况下。CrestOptics X-Light V3 拥有正确的硬件设置，可以快速、温和地处理您的样品，从而在低光照度下实现高图像质量。通过优化的光路（图 1）和最佳的旋转盘模式（图 2），可对活细胞进行成像，从而大幅降低了光漂白的几率。优化的光路与高效的荧光检测机制相结合，可以杜绝反射光。由于使用了灵敏度高达 95% 量子效率的相机，相比点扫描共聚焦中 PMT 的灵敏度为 45%，检测信号得到了最大化。此外，与宽视场荧光成像相比，照明和相机检测区域之间的适当匹配减少了视场 (FOV) 之外光毒性产物的产生。这意味着可以采用较低的激光功率和曝光时间来实现较高的共聚焦通量和速度。
图 1：X-Light V3 旋转盘共聚焦的示意图。激光通过多模光纤进入 V3，穿过微透镜阵列和激发滤光轮；准直光通过旋转盘针孔聚焦到样品上。样品的发射光经过分色镜、发射滤光片，选定的发射频率由相机进行检测。
A
B
C
Figure 2: A) High throughput, B) Standard, C) Deep penetration disks.
此外，我们的旋转盘可以根据不同的针孔大小和间距进行定制，以满足成像要求，并尽量降低光漂白的几率（表 1）。关于如何将旋转盘模式与应用相匹配的更多信息，请访问我们的“技术”网页。旋转盘的各种布局旨在为您的荧光标记样品提供针孔串扰和三维切片能力之间的最佳平衡。
此外，我们旋转盘的高转速 (15000 RPM) 可提供 1400 fps 的采集速度，再结合使用快速、高灵敏度的 sCMOS 相机，可以捕获快速、动态的生物过程。另一个有利因素是 FOV 的大小。25 mm 的 FOV 减少了收集足够数据所需的采集图像数量，再次降低了漂白的几率。此外，由于采用了微透镜技术，均匀的准直光束在整个 FOV 上提供了 90% 以上的均匀照明。最后，位于激发和发射光路的两个光圈有助于保持样品完好无损，并有助于使用低激发光。
事实上，由于在旋转盘前存在一个照明光圈，样品只暴露在一小部分激发光下，因此特征仍被完整保留下来。
旋转盘 |
应用 |
| 高通量 | 对薄型样品的超快速成像 |
| 标准 | 细胞单层或组织的活体成像 |
| 深度渗透 | 厚且散射的组织（超过 100 um） |
| 自定义 | 客户特定应用 |
表 1：X-Light V3 旋转盘布局选项。自定义旋转盘还包括在同一旋转盘上选择双模式。
X-Light V3 的活细胞成像功能在我们的应用说明中得到了展示。借助 X-Light V3，可以在大型 FOV 上进行快速活体成像，然后聚焦在一个单细胞上，以高分辨率跟踪溶酶体的动态（使用结构照明显微镜观察活细胞细节和动态）。IFT-NG 细胞的延时摄影以 187 fps 的高速采集率跟踪粒子沿着绿藻的纤毛微管上下移动（沿着绿藻的纤毛上下移动）。
我们进行了三维叠加和延时成像，准确地研究了蛋白质的定位和随时间变化的荧光稳定性，证明有可能在保持细胞健康和避免荧光漂白的情况下对内源性表达的荧光蛋白进行可视化（梦想成真：采用共聚焦显微镜进行长期酵母成像）。我们能够对生长在三维基质上的尤文氏肉瘤 A637 细胞进行长期活细胞实验。在一个 530 um 厚的样品上进行了 72 小时的延时实验，跟踪了细胞凋亡的效果（VITVO® 中抗癌治疗效果的活体成像）。
DeepSIM
小结构的动态事件需要采用超分辨率来解析，以真正鉴赏和理解真实的生物事件。一个能够同时提供避免伪影的超分辨率和高成像速度的可靠系统发挥着重要作用。DeepSIM 作为 X-Light V3 的一个附加模块（图 3A），具有快速成像的功能、足够的深度穿透力，而且无需使用特殊探头。DeepSIM 保留了 X-Light V3 的所有功能，从光源到摄像头都没有任何改变。这意味着进行成功的活细胞成像实验的所有优点都保持不变，同时增加了时间分辨率大于 10 fps (1024×1024 px FOV) 的超分辨率能力。只需点击一下，就可以将 X-light V3 的旋转盘从光路中移除，并切换到超分辨率模式（图 3B）。A
B
图 3：A) X-Light V3+DeepSIM 附加模块在超分辨率模式下的示意图。激光通过多模光纤从 V3 进入，经过微透镜阵列和激发滤光轮；旋转盘从光路中移除。准直光进入 DeepSIM，通过掩膜的针孔聚焦，晶格图案通过一个电动振镜投射到样品上。来自样品的发射光经过分色镜、V3 发射滤光片，选定的发射频率由相机进行检测。B) X-Light V3+DeepSIM 附加模块在旋转盘共聚焦模式下的示意图。激光通过多模光纤进入 V3，穿过微透镜阵列和激发滤光轮；然后准直光通过旋转盘的针孔聚焦，旋转盘被重新插入光路中。然后激发光绕过掩膜和振镜进入 DeepSIM。然后激发光到达样品，发射光通过与 V3 单机相同的发射路径发送到相机。
DeepSIM 是一种晶格多点结构照明系统，可提供约 100 nm 的 XY 分辨率和约 300 nm (100X, 1.45 NA)的 Z 分辨率的光学切片。我们提供三种多点掩模模式，以满足广泛的应用需求（见下表）。
A
B
C
图 4：A) 高通量, B) 标准， C) 深度渗透掩模。
掩模 |
应用 |
| 高通量 | 活体成像，薄型样品和厚型样品（高达约 50 um） |
| 标准 | 活体成像，薄型样品和厚型样品（高达约 100 um） |
| 深度渗透 | 密集且均匀的结构，深层成像（超过 100 um） |
表 2：DeepSIM 晶格掩模布局选项。
DeepSIM 用于活细胞成像的主要优势在于 Lattice SIM 技术。Lattice SIM 技术克服了传统 SIM 的局限性，它使用了具有多点图案而不是网格线的掩模，而且图案只进行横向移动，没有旋转。通过这种方式，有效地利用了光和时间，实现了对活体样品快速而温和的三维超分辨率成像。此外，多点图案提供了更高的对比度，使图像重建更加稳健。此外，DeepSIM 利用 X-Light V3 激发和发射路径，最大限度地提高光照度，将光漂白的变化降至最低。
请参阅我们最新的 DeepSIM 应用说明“使用结构照明显微镜观察活细胞的细节和动态”，了解 CrestOptics DeepSIM 在活细胞成像方面的优势。我们专注于 HeLa 细胞溶酶体，跟踪其快速运动，连续记录 30 秒，并对 HeLa 细胞分裂进行了 12 小时 15 分钟（15 分钟延迟）的长期成像。
得益于最新的技术优势，CrestOptics X-Light V3 和 X-Light V3 与 DeepSIM 相结合是对活体样品进行高分辨率和超分辨率成像的正确解决方案。 这些系统的另一个优点是多线激光兼容性，可以使用各种荧光团。您可以选择在可见光谱和高达 750 nm 的近红外范围内进行成像。这给活细胞成像实验带来了巨大的好处，因为可以使用远红和近红外光谱的标记物，降低了光毒性的几率，并允许多标记物选择，避免了通道渗漏。此外，X-Light V3 拥有两个摄像头端口，可以在两种模式下同时进行成像，从而为您的实验带来更大的灵活性。最后，我们系统的设计允许使用显微镜环境试验炉，将您的样品完全包裹并保持在受控环境中。由于与最常见的显微镜底座品牌兼容，对于那些需要更受控环境的样品，也可以使用载物台培养箱。
有关 CrestOptics X-LightV3 和 DeepSIM 的更多详细信息，请访问我们的产品页面。联系我们预订演示，亲眼见证一下它们强大的功能。
