细胞器是一种亚细胞结构，通过其分子组成和环境交互作用促成各种细胞功能的实现。
标准荧光显微镜技术在传统上用于细胞器研究，并专注于识别单个隔室的独特特征。然而，细胞器的精细结构以及许多关键的亚细胞细节小于 200 nm，因此无法通过衍射限制的常规显微镜予以充分表征。
成像技术的进步得以使多种细胞器的结构和动力学及其运动、交互作用和重塑的研究成为可能。在此背景之下，超分辨率 (SR) 显微镜技术的发展是超越光的衍射极限的关键驱动因素，从而使人们能够研究纳米层级的细胞结构和细胞器。
通过使用多点结构照明系统，DeepSIM 提供了可靠、便捷且价格合理的解决方案，以用于研究 XY 分辨率为 100 nm 的亚细胞结构，且无需任何特殊的样品制备方案。在“应用说明”中，我们展示了使用 DeepSIM 可在细胞和亚细胞水平上跟踪活细胞器的动力学。需要特别强调的是，我们专注于不同的细胞内结构，包括核内体、肌动蛋白、线粒体、微管蛋白、内质网 (ER) 和溶酶体等在光的衍射极限下才可发现的亚细胞细节。
SR 实时成像跟踪细胞骨架和核内体动力学
核内体是一种亚细胞细胞器，是内化的货物朝着不同的运输途径进行组织、分类的所在；且其含量回收由促进新肌动蛋白丝聚合的多分子复合物协调完成。
得益于 SR 技术在纳米层级上对细胞内结构展开的研究，肌动蛋白动力学在调节内体循环以及这两种细胞成分之间的交互作用方面的研究从而得到相当大的改进。
为证明 DeepSIM 在跟踪这些快速生物事件方面的最佳性能，我们对永久表达细胞骨架（肌动蛋白）和核内体标记物的细胞进行了实时成像。
在图 1 中，我们比较了宽视野 (WF)、共焦 (CF) 和 SR 图像，证明在三种成像模式之间分辨率在显著提高。
图 1：永久表达肌动蛋白（绿色）和核内体（青色）标记物的细胞的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像的比较。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM X-Light SR 系统并配置 CFI SR Plan Apo IR 60 倍水浸物镜获取。
此外，得益于 DeepSIM 高速采集模式，我们在连续 30 秒 SR 延时中捕获了相关数据。如图 2 所示，我们能够对 SR 中的快速事件进行监测，而不用担心其漂白效应，也无需证明图像质量和生物动力学如何随着时间的推移而得到保持。
图 2：显示稳定表达肌动蛋白（绿色）和核内体（青色）标记物的细胞 30 秒快速实时成像的影像。该延时影像依靠配备有 CFI SR Plan Apo IR 60X 水浸物镜的 DeepSIM X-Light SR 系统获取。
SR 实时成像显示线粒体网状结构细节。
线粒体是大多数真核生物的细胞动力库。它们由错综复杂的小管网络组成，且该类小管与其它细胞隔室紧密结合。
大多数线粒体结构的大小刚刚达到光学显微镜的分辨率极限，这使得使用衍射限制光学显微镜对其进行分析总是面临挑战性。在此背景下，SR 显微镜对线粒体形态、分布和线粒体间接触提供了额外观察力。
作为证据，在图 3 中，我们比较了 WF、CF 和 SR 图像，特别是如果我们关注错综复杂的小管网络（图 3B）时，证明三种成像模式之间的分辨率得到显著提高。
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B
图 3：永久表达线粒体标记物的细胞的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像之间的比较。显示细胞 (A) 的整个网络和线粒体细节 (B)的缩放。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM X-Light SR 系统并配置 CFI Plan Apo Lambda 100X 倍油浸物镜获取。
通过去除离焦和散射光，CF 成像可以提供关于 WF 模态的高质量图像；然而，为了观察折射率以下的生物细节，则需要 SR 技术。将 DeepSIM 提供的图像质量改善与对 CF 图像应用去卷积时实现的图像质量改进比较，因为已经证明其可改善线粒体结构检测（图 4）。
尽管 CF 采集去卷积增加了图像对比度，但与使用 SIM 可获得的分辨率相比，前者分辨率的提高非常有限（图 4A）。如强度分布分析所证实（图 4B），细微的线粒体间接触 (160 nm) 只能通过 SR 显微镜（绿线谱）有效区分，由此可查看线粒体网状结构的细节。
A
B
图 4：显示线粒体结构的去卷积 CF 和 SR 数据之间的平行比较。对线粒体间的接触 (A) 和相关的强度分布 (B)（红线和绿线分别代表去卷积 CF 和 DeepSIM 的强度分布）进行了显示。CF 图像的去卷积由 NIS Elements 软件提供的 3D Richardson-Lucy 算法执行。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM X-Light SR 系统并配置 CFI Plan Apo Lambda 100X 倍油浸物镜获取。
线粒体是一种高度动态的细胞器，为了维持其形状、分布和大小而经历分裂和融合循环。在展示了研究线粒体间和线粒体内结构需要获得分辨率方面的增益后，我们利用 DeepSIM 高速采集模式来研究这些线粒体动力学。
A
B
图 5：2D (A) 和 3D (B) 影像显示稳定表达线粒体标记物的细胞 30 秒快速实时成像。这些时间间隔通过配有 CFI SR Plan Apo IR 60X 水浸物镜的 DeepSIM 独立 SR 系统获取。
为此，在图 5 中，我们报告了 30 秒连续 2D（图 5A）和 3D（图 5B）延时摄影，以在亚细胞水平上跟踪线粒体运动。SIM 的使用增强了对比度，提高了线粒体结构的分辨率，从而使生物细节能够正确可视化，否则即使在应用去卷积算法后，标准显微镜方法也观察不到。
SR 实时成像增强了细节，并跟踪了主要细胞器的动力学。
内质网是最大的细胞器，它延伸到整个细胞质，从而与其他类型的细胞内结构接触。另一方面，溶酶体是一种小的亚细胞囊泡，含有负责消化核酸、蛋白质和多糖等大分子的水解酶。这两种细胞器都是细胞内最具活力的细胞器之一，许多科学家对跟踪此类结构非常感兴趣，同时保持高分辨率来区分单个囊泡，从而提高其结果的准确性。
A
B
图 6：溶酶体 (A) 和内质网 (B)染色细胞的快速实时成像。这些时间间隔是用配备有 CFI SR Plan Apo IR 60X 水浸物镜的 DeepSIM X-Light SR 系统获取的。
由于其 12 帧/秒的时间分辨率，DeepSIM 能够以高分辨率捕获有意义的数据，同时最大限度地减少光照和光毒性风险。可以在实时监测细胞和亚细胞变化的过程中探索精致的活标本。如图 6 详细报道，这种功能允许探索溶酶体囊泡（图 6A）和内质网运动（图 6B），证明随着时间的推移，可以以引人注目的分辨率快速监测生物事件。
结论
总之，这些数据表明 DeepSIM 将 SR 与高速成像、光效率和灵敏度相结合。利用 SR 技术对活细胞中的膜成像，从而对结构动力学予以揭示，这是理解细胞功能的关键。然而，这些细胞内运动中的许多反应发生得非常快，并且不容易跟踪这样的动态事件，特别是在我们考虑到 SR 技术需要采集创建一个超分辨率图像所需的一组原始图像的情形之下。因此，拥有一种能够以高帧频采集，而不会损坏样本或阻断正在进行的生物事件的仪器就显得非常重要。
在此背景下，由于其成像速度和分辨率，DeepSIM 能够轻松研究活细胞动力学，从而有机会在亚细胞水平上追踪快速的生物事件。
致谢
图 1、图 2、图 4 和图 5 所示的数据是在北海道大学举行的 2023 年成像训练营期间获得的。在此对 Fujioka 博士（北海道大学）的邀请和 Yasutomo Kubota（Givetechs）的安装支持表示感谢。
图 6A 所示的美丽的动态溶酶体已经用 Spichrome SiR 溶酶体探针进行染色；在此对 Spichrochrome 提供的这种出色的荧光探针表示感谢。
