超分辨率 (SR) 技术面临的最大挑战之一是，在跟踪生物事件动态的同时增强活细胞的亚细胞细节。由于采集速度慢、穿透深度不足以及需要特殊探针，目前 SR 商业解决方案的适用性仅限于整个活细胞成像需求的一小部分。
借助 DeepSIM，我们成功完成了一项重要任务，即提供一种可靠、易用且价格合理的解决方案，以扩展当前 X-light V3 旋转盘成像能力，从活体异质标本中获取 SR 数据。
在本应用说明中，我们证明了凭借 > 10 fps 的时间分辨率，Deep SIM 可以在细胞和亚细胞水平上跟踪活细胞动态。特别是，我们监测了快速生物事件，重点是溶酶体小泡的运动，以及较慢和持久的现象，例如细胞有丝分裂。
溶酶体囊泡的实时超分辨率示踪
为了证明 DeepSIM 在以下快速生物事件中的最佳性能，我们对永久表达 GFP-α 微管蛋白的 HeLa 细胞进行了实时成像，并使用 Spirochrome SiR 溶酶体探针对溶酶体进行了染色。
在图 1 中，我们比较了宽视野 (WF)、共焦 (CF) 和 SR 图像，证明其分辨率比传统显微术有显著提高。
图 1：比较表达 GFP-α 微管蛋白（绿色）和溶酶体染色（红色）的 HeLa 细胞的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。
此外，在图 2 中，在去卷积的旋转盘和 SR 数据之间进行平行比较，可以评价溶酶体囊泡的一些细节，相对于去卷积的 CF 图像，如何在 SR 图像中检测，更鲜明并且肯定更清楚。
图 2：显示溶酶体囊泡细节的去卷积 CF 和 SR 数据之间的平行比较；CF 图像的去卷积由 NIS Elements 软件提供的 3D Richardson-Lucy 算法进行。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。
由于可以将 CrestOptics X-Light V3 旋转盘和 DeepSIM SR 模块一起使用，因此可以在大视野 (FOV) 上进行快速实时成像（图 3A），从大量细胞中获得重要数据，然后聚焦于单个细胞，在亚细胞水平上跟踪溶酶体动态（图 3B）。
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图 3：HeLa 细胞溶酶体染色的快速实时成像。(A) 大视野中的 CF 采集；（B 顶部）CF 采集和单细胞聚焦；（B 底部）SR 采集和单细胞聚焦。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。
DeepSIM 高速采集模态允许以高分辨率捕捉相关数据，从而最大限度地减少光暴露和由此产生的光毒性风险。正如图 4 中报告的那样，这种功能可随着时间的推移探索精致标本的动态和追踪溶酶体囊泡。特别是，进行了连续 30 秒的 DeepSIM SR 延时（图 4A），监测快速事件而不用担心褪色。随着时间的推移，图像质量和溶酶体的运动性得以保持，这使得从溶酶体的跟踪中提取重要数据成为可能，例如囊泡移动的距离 (um) 和速度 (um/s)（图 4B）。
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图 4：SR 实时溶酶体跟踪。(A) 连续 30 秒 DeepSIM SR 延时；(B) 溶酶体囊泡移动的距离 (um) 及其速度 (um/s)。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。
这些数据共同表明，DeepSIM 结合了高速成像与光效率和灵敏度。快速生物事件可以在亚细胞水平上随时间推移进行监测，而不会出现褪色问题，从而有机会在活体标本上以高分辨率获取相关数据。
细胞分裂的长期实时超分辨率成像
为了证明 DeepSIM 在长期生物事件中的最佳性能，我们对 HeLa 细胞进行了实时成像，这些细胞分别用 Spirochrome SPY 505-DNA 和 SPY 555 微管蛋白探针进行了 DNA 和微管蛋白染色。
利用 CrestOptics X-Light V3 旋转盘和 DeepSIM SR 模块，我们有机会进行 CF 采集，以便对样本有一个总体了解（图 5A）。确定了感兴趣的区域后，由于不同成像模态之间的快速、简单切换，我们可以通过 SR 成像发现正在分裂的细胞并跟踪其整个有丝分裂过程。事实上，在图 5B 中报告了 33 分钟的实时 SR 延时，显示了不同的有丝分裂期，具有非常清晰的细节。
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图 5：在使用 Spirochrome SPY 505-DNA（绿色）和 SPY 555 微管蛋白（红色）探针染色的 HeLa 细胞上实时成像。(A) 大视野中的 CF 采集；(B) 单细胞聚焦，显示 33 分钟的实时 SR 延时。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。
传统结构照明显微术 (SIM) 的主要缺点之一是光子剂量及其与精细生物事件的兼容性；持续暴露在光线下会损害正在进行的生物现象，这可能是一个问题，尤其是当我们考虑 SIM 图像重建需要多个图像时。
在这方面，为了证明 DeepSIM 不牺牲样本活力和生理机能的能力，我们对细胞进行了超过 12 小时的监测，如图 6 所示，细胞的健康状况丝毫没有受到损害，细胞分裂和无细胞死亡就是证明。值得注意的是，随着时间的推移，图像质量依然得以保持，可进行更长时间的延时实验，而没有光毒性和光漂白问题。
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图 6：细胞分裂的长期 SR 成像。(A) 12 小时延时 SR 实验；(B) SR 中显示的有丝分裂期。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。
总之，这些数据共同表明，DeepSIM SR 模块的时间分辨率超过 10fps，光子负载低，能够轻松研究活细胞动态，并使用常规样本制备方案提供结构化定位成像。长期和快速生物事件都可以随着时间的推移进行监测，而不必担心褪色，从而有机会在亚细胞水平上跟踪生物动态，并利用 SIM 在活体样本上捕获有意义的数据。
显微成像方法
本应用说明的所有采集均通过 Nikon Eclipse Ti2 显微镜进行，该显微镜配有 CrestOptics X-Light-V3 旋转盘系统，还配备了 DeepSIM 超分辨率附件、LDI 激光照明 (89 North)、具有 6.5 um 像素的 Kinetix sCMOS 摄像机（光学性质）和 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜 (NA 1.4，WD 0.13)。
使用 Spirochrome 荧光探针进行细胞染色，用于活体生物成像 (Spirochrome)。特别是，我们使用 SPY 505-DNA、SPY 555 微管蛋白和 SiR 溶酶体探针标记细胞。
用于追踪溶酶体的电影记录了 30 秒，没有延迟；用于细胞分裂成像的电影记录了 33 分钟（3 分钟延迟）（图 5B）和 12 小时 15 分钟（15 分钟延迟）（图 6A）。
本应用说明中显示的 HeLa 细胞由 Consiglio Nazionale delle Ricerche c/o Sapienza Università di Roma 分子生物学和病理学研究所的 Lia Asteriti 博士和 Giulia Guarguaglini 博士提供。
